IVF相關數據分析

英國HEFA的年度報告我有空再來整理。
這篇來分享一下我今天讀到的這個paper，資料來源是荷蘭的這間 Maastricht University Medical Centre

這篇paper主要是在討論不同培養液對出生嬰兒的體重差異，在此先不討論。資料來源是在他們中心第一次做IVF的病人，小於40歲，BMI小於30，無高血壓。使用自己的卵子並且在當次週期植入(無凍胚)。

引起我興趣的是這張表，vitrolife跟cook是他們要比較的兩個品牌。

幾個有意思的數據: N=826

女方平均年齡33.1-33.3，活產率32.2%
女方年齡38-40歲，活產率4-5%

男方平均年齡36.1-36.2歲

做IVF的主要原因: 男方因素占55-60%
輸卵管佔15%，無法解釋佔20-24%

平均不孕年數: 3.3-3.5年
顯微注射比例: 57-65% (對照男方因素就一點都不意外了)
當次IVF無胚胎植入 6%
在Day 2植入 73%
在Day 3植入 21%

以前看過的統計數據是說不孕原因男女各占一半，看來在一些地方，不孕原因是男方佔大多數啊!

資料來源:
Dumoulin, J.  C., Land, J.  A., Van  Montfoort, A.  P., Nelissen, E.  C., Coonen, E.,
Derhaag, J. G., Schreurs, I. L., Dunselman, G. A., Kester, A. D., Geraedts, J. P.
et al. (2010). Effect of in vitro culture of human embryos on birthweight of newborns.
Hum. Reprod. 25, 605-612.

居家訂做你的寶寶(二)

續上篇

檔案點進去有更詳細資料介紹，但不是每個捐贈者都有各項資料。有進一步資料的捐贈者會有暱稱，基本資料的捐贈者則是數字編號。
從這裡可以聽見捐贈者聲音、使用該精子的寶寶照片，更多捐贈者願意透漏的進一步資料，工作人員對捐贈者的印象，EQ檔案等等。

因應不同國家需求，有些國家要求精子捐贈者必須為匿名或非匿名，非匿名捐贈者小孩有權在滿18歲之後知道生父。CMV指的是Cytomegalovirus (人類泡疹病毒?)，不確定中文名稱。這病毒常見於人體，美國感染率約50%-85%，有些開發中國家達到100%。一般來說並無症狀，極少數會影響到胎兒。如果媽媽本身有感染過已經有抗體，那選positive或negative都沒影響，如果媽媽本身是negative，選擇positive的精子有極微小的機會被感染，會建議選擇negative donor。
Pos: postive ； Neg: negative

選好之後可以直接購買(Purchase)或保存(Reserve)，因為精子有可能斷貨，如果希望第二胎也是同樣精子來源的話可以先保存，需要的時候再寄送。IUI和ICI的成功率約十幾%，平均需要六個cycle才會懷孕，建議先保存喜歡的精子以免缺貨。如果你已經懷孕，不需要保存的精子，而精子仍在cryos並未寄出，退貨可以拿回75%。stock可以看到他們有的精子數量。

ICI每次需要至少1ml含有 10 million精子，每管精子是0.5ml。至少需要兩管MOT 10，建議使用量每次兩管至少MOT 20來增進成功率。

選好之後去註冊然後結帳並且選擇寄送日期和方式，他們需要至少兩天的時間來準備寄出，精子在液態氮裡可保存七天。
寄送方式請選 World nitrogen tank return

居家訂做你的寶寶 (一)

本文適用於女同志伴侶或想成為單親媽媽的女性。

名詞簡介: IUI和ICI

IUI (Intrauterine insemination) 子宮內人工授精，俗稱的人工(受精)，需到指定醫療院所，台灣法規僅限已婚異性戀夫妻，將清洗過的精子用軟管打入子宮內。

ICI (Intracervical insemination) 子宮頸人工受精，本文要介紹的方法，可居家完成。將精子用無針頭針筒打入陰道內靠近子宮頸處。

精子差異: IUI注射精子需要清洗過以避免引發母體不適，ICI則可用"生"的精子或是冷凍精子皆可，因子宮頸有過濾作用，精子可以不須特別處理。

換句話說，IUI等級的精子可以向下相容做IUI或ICI，反之ICI等級精子則無法向上相容做IUI。

挑選冷凍精子

世界最大間的精子銀行是丹麥的Cryos，他們可以用個人名義訂購並且寄送到私人住家而不限於醫療院所。以下會介紹它們的訂購和解凍流程:

聲明:我跟這間精子銀行沒有任何關係，拿他們舉例是因為他們網站資料最詳盡，精子最多。(而且很勤勞跑各相關會議)

Cryos網站

https://dk.cryosinternational.com/

2015 Eshre的Cryos攤位

恭喜你! 這是個維京寶寶

網站點進去可以選擇各式精子捐贈者，他們的捐贈者還是以丹麥人為大宗。

這裡要注意的是亞裔裏面包含了南亞人種而不是台灣一般認知的僅限於東亞人種。印度、巴基斯坦、東南亞、東北亞都屬於亞裔的範圍。點進捐贈者資料可以看到族裔細項。

另外在眼珠顏色上，台灣人的眼珠會被分類成棕色(事實上他們也沒有黑色選項)。

下集待續~~

胚胎品質預測: 傳統型態學和電腦預測 (上)

胚胎學家的任務之一就是鑑別胚胎品質。傳統型態學是在固定時間點將胚胎取出觀看並做比對，在不同時間點將胚胎依照發育程度分級。

下面這張圖說明了在不同時間點胚胎發育的正常(上排)和異常照片。a是day 1合子期，正常可見雙原核(2PN)，異常發育則有無核(0PN，a圖左下)、單核(1PN，a圖中下)與3核(3PN，a圖右下)。b圖則是2-8細胞期的發育照片，正常2-cell要是均勻、大小相等的兩個細胞，4-cell也是要尺寸平均。發育異常的可以看到大小不一(b圖左下)、多核(b圖中下)、高度破碎(b圖右下)等情形。在morula stage要的是一整團細胞(c圖左)而不是細胞間有清楚分界(c圖右)。好的囊胚(blastocyst)要看兩部分: 滋胚層(Trophectoderm, TE)和內細胞團(inner cell mass, ICM)。TE要邊界清楚，細胞大小一致，囊胚腔(blastocoele)明顯；ICM要成團，邊界清楚。並且囊胚期的胚胎體積要開始增加。d圖上是正常囊胚，左下TE品質不良，中下ICM幾乎看不到，右下胚胎並未長大。

來源

根據以上的正常胚胎發育，可以針對不同天數、不同發育程度的胚胎給予不同分數。

例如下圖是4-cell stage的分級表，Grade 1最優，grade 5最差。

來源

囊胚期則有三項標準，囊胚擴張程度(1~6)、ICM型態(ABC)和TE型態(abc)。

囊胚擴張程度分級為:

1 囊胚腔少於一半體積

2 囊胚腔大於一半體積

3 囊胚腔完整但還沒擴張

4 囊胚已經擴張，比morula stage大

5 正在脫殼中

6 已經完全脫殼

ICM標準

A: 很多細胞形成一團

B: 細胞不夠團結

C: 細胞太少

TE標準

a: 很多細胞均勻形成完整一層

b: 細胞大小不一

c: 只有很少的幾個大細胞

到了這裡，囊胚就可以標準化用 1Aa, 6Bc等方式來表示和紀錄。這裡有各種不同等級的囊胚照片。

以上是傳統型態學的胚胎分級制度，電腦輔助下集待續。

懷孕，難或不難?

很多時候，懷孕是因為"意外"；也有很多時候，都準備好了才發現，原來，懷孕沒這麼容易。

那懷孕到底難不難呢??

根據統計資料顯示，女方年紀在40歲以下，未避孕的伴侶，在規律性行為之下，約有80%能在一年之內懷孕。而剩下20%未懷孕的伴侶，又有一半(10%)會在第二年之內懷孕。所以兩年之內九成的人都會懷孕。

然而，多久會懷孕? 這就是機率問題了! 第一個月就懷孕的比率只有20%左右，到了第六個月，則有超過半數的人能夠懷孕。

所以，一次沒中很正常，兩次沒中的你還是大多數。放輕鬆，認真做愛，建議陰道性交的頻率是每兩三天一次*。

但是，目前WHO對於生育力低下**(subfertility)的定義是未避孕並且有規律性行為滿一年而尚未懷孕的伴侶，建議尋求診所進一步釐清未懷孕的原因。

*National Collaborating Centre for Women’s and Children’s Health. Fertility: assessment and treatment for people with fertility problems. London: Royal College of Obstetricians and Gynaecologists, 2013.
**以前是叫不孕(infertility)，但其實一年未懷孕不代表無法懷孕，所以現在改成生育力低下(subfertility)

證人制度和選擇性單一胚胎移植

先介紹一下HEFA規定的證人制度

所謂的證人制度就是，當有需要移動任何樣品(卵子、精子或胚胎)時，除了操作者之外，都需要有另一名證人過來協助核對標籤是否正確並簽名。多這個動作不難，但是可以確實降低弄混樣品的比率。所謂的移動是指把樣品從一個標示的容器移動到另一個新標示的容器當中。只要在同一個容器當中，拿去離心或是拿去顯微鏡底下看的操作是不需要證人的。

至於選擇性單一胚胎移植則是HEFA從2009年開始力推的政策，其目的在於降低多胞胎姙娠比率。目標在把多胞胎懷孕比率壓低到10%以下。2009年開始實施的時候，多胞胎比率為24%，2012年已經降到15%。

植入胚胎數目HEFA明確規定40歲以下女性單次IVF cycle最多兩顆，40歲以上女性使用自己卵子可植入三顆或以上。這方針有效降低了三胞胎(或以上)的比率，但雙胞胎比例仍高。

目前的政策則是，37歲以下，第一次做IVF，只植入一顆選擇性胚胎。超過37歲或是第二次以上的IVF cycle才考慮植入兩顆。目前成效是第一個cycle 67%是單一植入，第二個cycle也有17%是單一植入，約有三分之二女性在接受IVF時小於37歲。

至於懷多胞胎的風險就不多提了。總之，多胞胎對母體、對胎兒都是高風險行為，並且早期子宮環境的影響層面可以延續到成人，不是生出來順產就沒事了。人類不是設計用來生多胞胎的，能免則免。

另類雙親

本文是我對Sarah Templeman (Nurse Manager, Herts and Essex Fertility Centre) 在2015 Fertility演講 "Alternative Parenting: A Clinic's Journey" 的摘要及心得。

演講中Sarah分析了過去十年來診所中的趨勢變化。在2004年，單身女性尋求(Assisted reproductive technology, ART 人工協助生殖技術)療程會被視為"另類" (alternative)。在2004年時沒有標準化的兒童福利評估表，每間診所有各自獨立的方針，有些診所則需要等待倫理委員會開會。

從十年來的捐贈精子使用者也可以看出這一趨勢的變化，2004年以異性伴侶(Male Partner，下圖藍色)占多數，隨著ICSI (單一顯微精蟲植入技術)的普及，使用捐贈精子的異性伴侶數目逐年降低而單身女性(下圖紅色)和同性伴侶(下圖綠色)數目逐年增加。

資料來源: Herts & Essex Fertility Centre

該診所接到第一對女性同性伴侶是在2004年，工作人員彼此諮詢過，少數持保留態度而多數持正面意見。持保留態度的工作人員可以選擇不涉入這群人的療程。到了2014，該診所已經完成30例女性同性伴侶療程。

現在女性同性伴侶可以選擇要怎麼創造她們的家庭，她們可以選擇適合她們的療程，也可以選擇另一半的參與程度。她們可以由其中一人提供卵子，而另一人懷孕。也可以加入卵子分享計畫，捐贈自己一半的卵子並且得到免費的IVF。

診所的第一對男性同性伴侶則出現在2012年，那時所有診所的工作人員都已經完全接受同性伴侶了。男性同性伴侶需要適合的孕母代孕，多半的療程使用捐贈卵子和另外獨立的孕母代孕，少數則使用孕母本身的卵子代孕。現在診所有25對男性同性伴侶登記等待療程，也有10對男性同性伴侶已經完成療程建立家庭了。

有三個父母親的女孩

BBC這篇寫得不錯，簡單摘要一下
The girl with three biological parents

今年15歲(2000年出生)的Alana Saarinen是世界上極少數的三親小孩之一。90年代晚期，在美國紐澤西州的Dr Jacques Cohen開始嘗試細胞質轉移(cytoplasmic transfer )，將捐贈者包含正常mtDNA的細胞質轉移到病人的卵子當中，受精之後培育成胚胎。

Cohen的診所中總共有17個嬰兒經由此技術誕生，在12次的懷孕當中有一次的早期流產。Cohen認為該次流產是是因為胎兒缺少了一條X染色體而導致的。

另外一次雙胞胎懷孕中，雙胞胎的其中一個也被認為少了一條X染色體。在人數如此少的例子當中出現兩次異常讓Cohen擔心並且提出報告。

其他出生的小孩則被認為一切正常，直到一兩年之後其中一個小孩被診斷出有包含自閉症在內的一連串早期發育障礙。Cohen說沒有辦法知道這些異常是機率問題還是細胞質轉移而引發的。在此同時也有其他診所複製此技術，全世界大約有30~50個三親嬰兒誕生。

2002年，美國FDA基於安全和倫理問題，要求診所停止細胞質轉移技術。

Alana Saarinen的母親說Alana是個完全正常的十餘歲青少女。

後面Sharon Bernardi 和她七個夭折孩子的故事前一篇提到過就不翻了。

個人意見:

Jacques Cohen使用的細胞質移轉技術和Lyndesy Craven用的原核移植(Pronuclear Transfer, PNT)技術上不太一樣。Jacques Cohen是把約5~15%卵子體積的捐贈卵子細胞質打入問題卵子當中，之後再受精。

PNT是把受精之後的胚胎原核取出，移植到已經取出原核的捐贈胚胎當中。

至於這兩種方法哪一種比較好? 目前沒有人知道。

三親嬰兒，我們準備好了嗎? (下)

續上篇

三親嬰兒，我們準備好了嗎? (上)

粒線體的替換: 實驗策略

將捐贈卵子的細胞核(下圖黃色)移除，同時把有粒線體突變的卵子細胞核(下圖藍色)取出植入已經移除細胞核的捐贈卵子當中。如此一來，這顆卵子將擁有原來的細胞核基因組和來自正常第三人的粒線體基因組。

綠色: 正常粒線體；紅色: 突變粒線體

圖片來源: Lyndesy Craven 演講

粒線體的替換: 技術層面

技術層面來說，DNA核移植可以在卵子或是合子(zygote)階段。合子階段則是取出胚胎原核(pronuclear)之後植入已移除原核的捐贈胚胎當中。此技術稱為原核移植(Pronuclear Transfer, PNT)

黃色: 捐贈胚胎原核，藍色: 帶有突變mtDNA的胚胎原核

圖片來源: Lyndesy Craven 演講

從上圖中可以看到，PNT還是有機會攜帶少量原先的突變粒線體。平均來說PNT攜帶的原粒線體比例小於2%，多數移植胚胎攜帶的原粒線體比例低到無法測到。

Newcastle Fertility Centre現在使用捐贈作為研究用途的卵子來強化PNT的技術。PNT的安全和效率取決於胚胎發育、胚胎品質和mtDNA、基因組DNA的遺傳分析。

法律層面

2005年9月: HFEA (Human Fertilisation and Embryology Authority) 同意在人類胚胎上發展相關技術來預防mtDNA疾病。

2008年11月: 經過兩年的辯論之後，HFE Act 修正案在國會通過。這包含了臨床許可使用"改變卵子或胚胎的DNA技術來預防嚴重的粒線體疾病傳播"。

安全議題

目前並無證據顯示此技術上的不安全，2013跟2014年由各自獨立的科學研究提出相同的結論。

公眾意見

2012年1月: 英國政府要求HFEA尋求大眾對於使用IVF技術來預防粒線體疾病傳播的意見。

2012年7月至8月: 公開意見的尋求包括審議性公開研討會以及公眾代表性的調查。

2012年9至12月: 公開協商時期

2013年3月: 公眾諮詢結果

"原則上同意英國的粒線體療法"

2013年6月: 政府公布臨床應用粒線體療法的草案

2014年12月: 粒線體療法草案排入議程

2014年2月3號: 英國下議院投票通過粒線體療法

下一步

1.草案通過之後的細節仍需要HFEA同意

2."治療許可"仍舊需要申請以及許可，只有HFEA同意有效及安全的方法才會獲得許可。

3. 申請許可的診所必須符合科學以及臨床規定，包含病人的支持。

4. 對於子代的長期追蹤

三親嬰兒，我們準備好了嗎? (上)

本來還有其他好幾篇要寫，不過看到這則新聞:
'Three-parent babies': Britain votes in favour of law change

三親嬰兒，英國通過法律允許粒線體療法。
就先來談談這篇

以下文章是我對於Lyndesy Craven (Wellcome Trust Centre for Mitochondrial Research) 在2015 Fertility conference 上演講的個人理解。

粒線體(mitochondria, mt)簡介:
粒線體是細胞的能量工廠，負責提供能量給細胞。在胞器中，粒線體和植物的葉綠體是惟二含有自己DNA的胞器。粒線體DNA可以通過複製自身粒線體而代代相傳下去。

人類基因組DNA中約有1300個粒線體相關蛋白質，粒線體DNA長度為16,569bp，佔所有人類基因組不到0.1%，含有13個粒線體蛋白質。，有大於300個疾病導致的突變。粒線體DNA的其他幾個特色是multicopy跟母系遺傳，multicopy比較無關先不解釋。母系遺傳是因為粒線體在細胞質當中，精子本身的粒線體進入卵子之後會被淘汰，所以胚胎只會繼承到母方的粒線體DNA。


下圖: 母系粒線體用綠色表示，父系粒線體是黃色。受精之後父系粒線體會被排除而只剩下母系粒線體。

圖片來源: Lyndesy Craven 演講

粒線體的異質性(Heteroplasmy)
一個細胞含有數百個粒線體，這些粒線體不一定全都是一種表現型，它們可以同時包含正常型和突變型

下圖: 正常粒線體用綠色表示，突變是紅色
上: 同質性野生型(正常)的粒線體，全正常
中: 異質性，有正常有突變
下: 同質性突變，全是突變

圖片來源: Lyndesy Craven 演講

粒線體異質性的影響:
當heteroplasmy的細胞分裂的時候，它有可能包含到更多的正常粒線體或突變粒線體，最後表現出不同的表現型

上: 正常粒線體多於突變種，表現型正常
下: 突變粒線體多於正常，表現型突變

圖片來源: Lyndesy Craven 演講

當這個heteroplasmy細胞是生殖細胞的時候會造成各種程度不同的突變，粒線體在細胞內是以倍數自行增加的

圖左是含有粒線體突變的原始生殖細胞(Primordial germ cell)，當細胞分裂成初級卵母細胞(Primary oocytes)時，卵母細胞可能會含有不同數量的突變粒線體(圖中)，這些粒線體會自我複製而造成最終不同的表現型(圖右)。右上方含高比例的突變粒線體，會對子代產生影響，中間有中等程度的突變粒線體，對子代的影響較輕微，右下圖含少量突變粒線體則不影響子代。

圖片來源: Lyndesy Craven 演講

那究竟粒線體突變會造成什麼影響? 因為粒線體遍布人身上的各種細胞，它可以對多個器官/組織產生影響。

以下示意圖: 這些都是粒線體突變的影響範圍

圖片來源: Lyndesy Craven 演講

粒線體疾病可以造成嬰兒死亡，例如以下這篇報導
The woman who lost all seven children
Sharon Bernardi 的前三個小孩死於出生後數小時之內，第四個小孩雖然存活下來但一直有神經系統方面的疾病，最後在21歲死亡。之後Sharon Bernardi又懷孕三次，但沒有一個活超過兩歲。她被診斷出是她的mtDNA疾病造成胎兒異常。

預估在英國約有6500名女性受到mtDNA疾病影響或是帶有風險，然而目前針對mtDNA疾病並無有效治療方法。

現今對於病人帶有粒線體疾病的幾個意見:

1. 遺傳諮詢

2. (使用)捐贈卵子

3. 產前診斷

4. 著床前基因診斷( Preimplantation genetic diagnosis, PGD)

5. 粒線體取代療法?

產前基因診斷(PGD)在Newcastle的現況:

從2009年起，總共執行了10個cycle的PGD，確診出6種不同的mtDNA突變，其中3個PGD cycle成功的懷孕。低突變率的胚胎被挑選出來植入，隨後出生的嬰兒被確診有低突變率的mtDNA。

PGD用在篩選mtDNA突變可以降低疾病風險然而有其限制:

--當病人只有同質型突變的mtDNA

--當病人只有高比例突變的胚胎時

即使怎麼用PGD篩選也找不到適合的胚胎可以植入，所以有必要發展其他技術來預防mtDNA突變。
(下集待續)